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3D打印具有生物催化功能的活体材料

时间:2021-12-29 10:22 来源:智能材料与再生医学实验室 作者:admin 阅读:
极光尔沃
        生命的组成部分主要来源于能够形成或组装具有高级结构和复杂特征的生命系统的生物体。作为这类生物体的一个组成部分,细胞可以被招募来构建用于能量收集、传感、修复和驱动的合成生物材料或结构。在这方面,细胞要么构建材料本身,要么以特定方式调节材料的功能性能。例如,转基因微生物已被用于产生细胞外基质材料;这些材料已被用于多种应用,如生成自组装层次结构、发现新型功能聚合物以及维持此类结构以响应环境刺激。此外,微生物可以在生物混杂材料工程中与脱细胞成分协同工作,从而产生从生物制造和生物修复到生物医学工程的潜在应用。尤其是生物催化活性材料,由于其在广泛领域的适用性,最近引起了科学家们越来越多的兴趣。作为生物催化剂的微生物可以通过自然或精心设计的细胞内化学级联反应将底物转化为有价值的化学品,因此它们经常用于发酵和污染物去除等领域。尽管前景看好,但将功能微生物与生物加工相结合的想法尚未得到充分探索。一个挑战是,整个过程需要在材料可制造性与细胞活力和功能性之间取得平衡。此外,由于生物加工过程的动态控制仍然是该领域最大的挑战之一,因此迫切需要能够创建具有明确3D形状的定制活体材料的策略,特别是在以空间方式进行分布的同时改变其组成和功能特性。
       有鉴于此,南京工业大学材料化学工程国家重点实验室的余子夷、陈苏教授团队开发了一种具有生物催化功能的活体材料,其由双网络高分子和微生物细胞共同构成,并且其可用作生物墨水,通过生物3D打印设备进行精准制造。
       相关研究工作以 “3D Printed Biocatalytic Living Materials with Dual-Network Reinforced Bioinks” 为题发表在《SMALL》期刊上,该研究得到了国家重点研发计划 “合成生物学”重点专项、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金等项目的资助

NO.1
      为了生成可印刷油墨,首先,在室温下,在 PBS 缓冲盐水中,将全功能化的 HA 聚合物与 CB[8] 预复合。HA 中带 N 端电荷的苯丙氨酸能够与 CB[8] 以 2:1 的比例形成同质复合物,从而产生具有物理交联 3D 网络和宏观可逆触变性的超分子凝胶(图 1a)。然后通过将超分子凝胶与微生物混合来获得生物墨水。
        其次,使用载有微生物的 CB超分子水凝胶来数字打印有利于长期细胞功能的活体 3D 支架。Bioinks 被加载到配备三轴机械机械臂的压力控制分散盒中(图 1b)。为了确定打印分辨率,作者分别打印了具有 1500、840、580、410 和 250 μm 不同喷嘴直径的 2D 蛇形图案(图S6,支持信息)。打印的细丝在整个图案上具有均匀的厚度,在 250 μm 处显示出良好的打印分辨率。CB[8] 介导的超分子水凝胶适用于 3D 打印,因为它在通过打印针挤出时具有剪切稀化行为(图 1c))。打印完成后,在紫外线辐射下启动二次共价交联,以提高结构的机械性能,这有利于水凝胶的进一步处理和长期细胞培养(图 1d)。

图1 基于功能化的透明质酸的双交联载体的设计

图S6  喷嘴直径分别为250微米、410微米、580微米、840微米和1500微米的二维蛇形图案(从左到右)比例尺为3毫米

NO.2

图 2c表明 CB-HA 和 CB-HA-细胞的临界应变约为 200%,而 HA-细胞的损耗模量几乎等于其储能模量,进一步表明添加 CB 交联剂后机械性能的提高。紫外线照射后,材料的储能模量增加了10倍,在8000Pa左右。值得注意的是,材料中酵母细胞的存在并未显着改变其流变行为,因为线性粘弹性区域中含有细胞的样品的动态模量与不含细胞的样品的动态模量接近。此外,应变恢复是基于软物质的 3D 打印应用的关键特征,因为它可以快速恢复机械性能,从而确保打印后的结构保真度。 图2d表示了水凝胶的循环流变测试。在较低的应变下,水凝胶储能模量超过损耗模量,并在应变急剧变化后立即以相反的方式表现。剪切稀化是设计 3D 可打印墨水的另一个不可或缺的因素,因为它允许通过打印针轻松挤出,其中由于收缩而显着增加了剪切应力。所有三个样品在更高的剪切速率下都显示出剪切稀化行为(图 2e),显示出它们在基于挤出的 3D 打印应用中的应用前景。除了流变学特征外,细丝塌陷(图S7a,支持信息)和细丝融合(图S7b),支持信息)进行了测试以表征生物墨水的机械性能。作者还通过扫描电子显微镜 (SEM) 检查了生物墨水的表面形态。然后,作者探索了 CB生物墨水对基于挤出的 3D 打印平台的适用性。生物墨水由气泵挤出和控制,并使用机械臂来操纵喷嘴的运动以确保墨水的准确沉积(图 2f)作为演示,制造了具有高结构的3D晶格立方体保真度。打印后,将 3D 结构在 Irgacure 2959 存在的情况下暴露于紫外线下 3 分钟,以增强其机械刚度。为了证明 bioinks 的生物相容性,嵌入的酵母细胞用活/死荧光染料染色。如图 2h和图S9所示, 支持信息,在紫外线照射后,大多数酵母细胞存活,细胞活力高达 85%,这表明材料和交联程序没有显着影响细胞活力。SEM 图像显示 3D 晶格具有亚毫米孔(图 2i-k),具有逐层堆叠结构(图 2j)。此外,载有细胞的 3D 晶格的 SEM 图像显示酵母细胞(通过成像处理呈黄色)位于 HA 基质上(图 2k)。

图2 活体材料的3D打印

图S7(a) 水凝胶丝断裂试验的示意图

图S9 悬浮酵母细胞的荧光显微图像。比例尺代表50μm

NO.3

利用酵母对葡萄糖的厌氧发酵来证明该平台的适用性。作者设计了一种酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YPD) 培养基回收装置(图 3a),旨在最大限度地提高发酵过程中的生产力。载有细胞的 3D 晶格与与对照组相同成分的大块水凝胶一起制造(图 3b)。作者首先测试了材料的细胞相容性,其中酵母细胞被嵌入大块双交联水凝胶中并孵育 16 小时。结果如图S11, 支持信息,可以注意到细胞增殖,因为孵育 16 小时后细胞密度增加。为了测量这两个生物反应器的代谢活性,作者评估了它们在 15 小时内的整体乙醇产量,这表明 3D 晶格产生的乙醇明显高于其本体对应物。作者进一步评估了乙醇生产力的进展和发酵过程中这两种结构的产量。图 3c,d总结了 3D 晶格和块状水凝胶的乙醇生产率和产量,按各自的权重归一化。两种结构都能够从一开始就产生乙醇,而在整个发酵过程中,晶格的乙醇产率高于散装水凝胶。作者将这种差异归因于晶格的比表面积增加,这促进了反应物和产物与环境的交换。整体发酵动力学显示出一条 S 形曲线,晶格和散装水凝胶的乙醇生产率在大约 3 小时达到峰值,然后缓慢下降,直到此后达到平台期。发酵15 小时,充满细胞的晶格内产生了 17.9 g·L-1 的乙醇,大约是其块状对应物的两倍。

图3 生物催化活体材料的发酵性能

图S11  在发酵和冷冻干燥一个月后,活酵母细胞在不同深度嵌入3D支架中的共焦显微图像。比例尺代表50μm


NO.4

为了进一步证明作者方法的多功能性,作者创建了一个用于生物修复的细菌-微藻共培养生物材料系统。生物修复已成为比传统方法更具优势的替代方法,例如物化吸附、化学氧化等昂贵且容易造成二次污染的方法。相比之下,生物解毒更环保,因为它通过生物转化将有害的有机化学物质代谢成无害的 CO2。在此,作者研究了用于去除丙烯酰胺和甲基橙的芽孢杆菌-小球藻共培养系统。枯草芽孢杆菌能够利用有机化学品作为碳源并将其转化为 CO2,CO2依次被普通小球藻捕获并通过光合作用转化为氧气(图 4a)。反之,小球藻产生的氧气被枯草芽孢杆菌捕获进行有氧呼吸,形成良性生态循环。然后作者将该共培养系统固定到 CB[8] 介导的双网络水凝胶中,并通过增材制造构建 3D 晶格。细菌-微藻共培养系统的3D模型如图4b所示 . 在共聚焦显微镜下,在发出强烈红色荧光的叶绿素(图4c)的存在下,印刷的晶格看起来是绿色的 ,这表明存在大量活的小球藻细胞。载有细胞的晶格的 SEM 图像显示出与含有酵母细胞的晶格相似的表面形态(图 4d),这表明加载两种类型的微生物不会破坏晶格的多孔结构。打印和固化后,将装有细菌和藻类的格子支架置于合成介质中。如图4e所示 ,支架膨胀了大约 1.5 倍的重量(图S12,支持信息)。嵌入式共培养系统经过 12 小时光照和 12 小时黑暗循环以实现高性能。检查了细菌-微藻系统降解有机物质的能力(图 4f)。降解动力学表明,在前 12 小时内,大约 70% 的甲基橙被去除,而芳酰胺则被去除了 40%。48小时后,90%以上的有机物被降解。

图4 多细胞生物活体材料用于二氧化碳固定和生物修复

图S12  负载微生物的3D结构的溶胀率(a)负载酵母细胞,(b)负载细菌微藻

     综上,该工作利用动态化学以及双交联网络的方法,成功开发了一种新的可打印的生物墨水,制造了在微尺度空间固定微生物和构建多细胞共生的生物活体材料,实现了生物催化的强化。利用3D打印技术,提高了整个材料的传质效果,和传统的大块材料相比,显著提高了材料的生物催化效果。同时,该材料还具有可循环性,并且在低温或者冻干的保存条件下依然保持了良好的催化活性。这项工作为探索新的生物相容性良好的可打印生物墨水提供了一个新的突破。

文章链接:https://doi.org/10.1002/smll.202104820

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