清华BRE团队AFM：载细胞微凝胶双相生物墨水的3D生物打印(2)
时间：2021-12-17 17:12 来源：生物打印与再生工程 作者：admin 阅读：次
4. MB生物墨水的超弹性
使用5.0wt% GelMA制备的MB墨水、JM墨水、纯GelMA墨水打印直径10mm、高5mm的圆柱并比较力学性能，MB墨水(2.7±0.3 kPa)和JM墨水(2.2±0.2 kPa)弹性模量明显低于纯GelMA墨水(15.4±1.0 kPa)，但却比纯GelMA墨水有更大的弹性，这可能是由于微凝胶的位移所产生的。对于MB墨水来说，微凝胶在压缩的情况下被限制在连续相中，因此与JM墨水相比，其弹性模量相对较高。
对于纯GelMA墨水，在40%应变的几个压缩循环后，疲劳裂纹很快在打印的圆柱内开始增长。同样，对于JM墨水，在60%的应变下，打印的圆柱在少于20次压缩循环后迅速疲劳，最大应力减小50%。然而，对于MB墨水，打印的圆柱可以在60%的应变下重复压缩1000次。MB墨水组的所有滞回曲线重叠非常好，表明其超弹性，在数千次加载下几乎未发生塑性变形。
打印了一些条带来检测在单轴拉伸和循环拉伸下的力学性能，MB条带在拉伸时的断裂应变(141.7%±5.2%)远高于纯GelMA条带(63.8%±3.1%)，MB条带弹性模量(4.3±0.7 kPa)远低于纯GelMA条带(20.7±1.2 kPa)，与压缩的结果一致。而JM条带的机械性能较弱，很容易在拉伸下断裂，表明添加连续相来将微凝胶整合在一起对MB墨水至关重要。MB条带可以通过高达100%应变的极端变形拉伸，并在松弛后恢复到原来的形状。冻干结构的扫描电子显微镜(SEM)图像证实了MB墨水的特征粒度，断裂区域的大部分微凝胶看起来仍保持完整或完全脱离连续相。
在不牺牲打印性的情况下，可以通过调整微凝胶和连续相的刚度而改变MB墨水的机械性能。例如，通过调节光照强度和曝光时间调节GelMA微凝胶的硬度，由较硬的微凝胶(弹性模量65.3±11.6 kpa)构成的MB墨水打印的圆柱弹性模量为9.4±1.1 kpa，由较软的微凝胶(弹性模量为30.1±8.6 kpa)构成的MB墨水打印的圆柱弹性模量为4.7±0.7 kpa，这主要是由于更硬的微凝胶在压缩下变形较小所致。以5.0wt% GelMA(2.7±0.3 kPa)作为连续相的MB墨水比分别以2.5wt%GelMA(2.2±0.1 kPa)和1.5wt%海藻酸钠(1.7±0.2 kPa)作为连续相的MB墨水更硬、更坚韧。同时，较低浓度(2.5wt%)的GelMA和海藻酸钠作为连续相形成的MB墨水也表现出超弹性，在60%应变下压缩1000次后，疲劳裂纹没有扩展。在微凝胶/连续相内添加细胞后，MB墨水的压缩模量得到增加，可能是由于微凝胶和连续相中细胞的颗粒强化效应所致，但其循环性能似乎有所下降。
图4 MB生物墨水打印结构的力学特性
5. MB生物墨水的异质微环境对肝功能的促进作用
MB生物墨水可通过连续相、微凝胶分别包裹不同的细胞，从而在单个打印微丝内创建一个异质性的细胞微环境。将HepG2和HUVEC分别封装在7.5wt% GelMA MB墨水的微凝胶和连续中，同时HepG2和HUVECs以相同的细胞密度直接混合作为对照。载HepG2的微凝胶细胞活性约为90%，且能正常表达白蛋白，使用MB墨水打印的组织在长时间培养后保持了结构完整性和较高的细胞活性。
使用CellTrackerTM荧光探针对HepG2(红色)和HUVECs(绿色)进行标记。在MB墨水中，HUVECs主要分布在微凝胶空隙。与纯水凝胶墨水组相比，MB墨水组的HUVECs在第3天和第7天表现出更高的增殖率，形态拉长，可能是MB墨水中与内皮细胞限制相关的富集效应，导致肝脏和内皮细胞局部细胞密度增加以及细胞相互作用增强。在第6天用HepG2白蛋白和HUVECs抗血管性血友病因子(vWF)免疫染色打印的结构，观察到MB墨水中，HUVECs扩散较好，通过内皮细胞组装形成随机的管状血管结构，覆盖在HepG2微凝胶表面。与水凝胶墨水相比，MB墨水中毛细血管状网络形成更好(总长度、单位面积分支数、平均长度)。
图5 3D打印构建具有可调异质微环境的血管化肝组织模型
相比于水凝胶墨水，MB墨水打印的肝组织表现出更高的增殖率。MB墨水组织和水凝胶墨水组织的白蛋白和尿素水平初始均低于二维培养模型，但在Day7时，MB墨水组＞水凝胶墨水组＞二维培养组。在细胞色素P450同工酶中选取CYP3A4和CYP1A1评估酶活性，结果表明，MB墨水组＞水凝胶墨水组＞二维培养组。
与水凝胶墨水组相比，MB墨水组的成熟肝脏标志物TTR、ALB在Day10的表达水平明显升高，而胎儿肝脏标志物AFP的表达水平无明显差异。western blot分析显示，与水凝胶墨水组相比，MB墨水组总体白蛋白和MRP2蛋白水平较高。此外，MB墨水组第7天CD31表达显著升高。这些发现证明了MB墨水中肝细胞的基因和蛋白表达更为成熟。
图6 肝功能检测及肝特异性基因和蛋白表达水平
总结
本研究中，BRE团队开发了一种由微凝胶和连续相所组成的载细胞双相生物墨水，能够通过墨水的流变特性(如剪切稀化、应变屈服、自愈合)提供更宽的生物打印窗口和优异的生物打印能力。该生物墨水具有很好的超弹性能，同时能够通过在微凝胶和连续相中添加不同类型细胞的方式，来构建具有异质细胞微环境的组织模型，为生物墨水的设计提供了更灵活的选择。未来，载细胞双相生物墨水可以进一步与当前的打印策略相结合，以更好地模拟天然组织和器官的结构复杂性和异质性，同时也拓展了3D生物打印在组织工程和软体机器人等生物医学领域中的应用。
关于BRE(Bioprinting and Regenerative Engineering)课题组
● 清华大学机械工程系生物制造中心熊卓副教授：长聘副教授，特别研究员，博士生导师，现任北京机械工程学会副理事长，北京市生物制造及快速成形重点实验室副主任。2001年清华大学机械工程系参加工作，2005 年晋升副教授，2010 年晋升教授。曾任第四军医大学客座教授、军事医学科学院基础医学研究所客座研究员、清华大学深圳研究生院兼职教授等职务。曾担任中国机械工程学会理事、中国机械工程学会生物制造分会常务委员/总干事、中国宇航学会航天医学工程与空间生物学专业委员会委员等学术兼职。是最早进入到生物制造这一新兴的交叉学科研究领域，将3D打印技术拓展到生物医学领域的研究者之一，长期从事细胞3D打印、生物制造和心肌组织工程等领域研究。发表的学术论文被 SCI 收录 41 篇、 Ei 收录 52 篇，在 SCOPUS 中被引用2900余次，H 因子 29，获得中国发明专利授权17 项。曾获得 6 项国家自然科学基金资助，担任其中 3 项的负责人。曾获北京市科学技术奖一项。
● 清华大学机械工程系生物制造中心张婷副研究员：副研究员，博士生导师。现任中国机械工程学会生物制造工程分会总干事，中国生物材料学会生物材料先进制造分会秘书长。主要从事各类生物 3D 打印技术装备研发、心肌组织工程与血管化、体外微环境及生物 反应器、组织/细胞芯片等生物制造相关交叉领域的研究，并作为访问学者在哥伦比亚大学 Gordana Vunjak-Novakovic 教授团队从事心肌组织工程领域的研究工作。先后主持或参与国家自然科学基金青年基金、中韩国际交流基金，国家自然科学基金重点项目，863 计划课题、“重大新药创制”国家科技重大专项等科研项目十余项，参与撰写 3D 打印相关的书籍 1 本，在 Biofabrication, PLOS ONE, AdvanceHealthcare Materials 等期刊及国际会议上发表论文 30 余篇，申请或授权发明专利十余项。
参考阅读：
Yongcong Fang, Yihan Guo, Mengke Ji, Binhan Li,Yujiang Guo, Jieming Zhu, Ting Zhang*, Zhuo Xiong*, 3D Printing of Cell-LadenMicrogel-Based Biphasic Bioink with Heterogeneous Microenvironment for BiomedicalApplications, Advanced Functional Materials, 2021, 2109810.
https://doi.org/10.1002/adfm.202109810
(责任编辑：admin)
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